丨摘要

牙髓干细胞是一类具有自我更新、多向分化、高度增殖能力的外胚间充质干细胞，可为组织器官修复和多种疾病治疗提供细胞来源。本文通过总结相关文献，对牙髓干细胞的一般生物学特性进行论述，并探讨其成骨/成牙本质、成肌/成血管和神经再生的机制，以及其在糖尿病和眼部疾患的临床前应用。同时结合了国内外有关牙髓干细胞的最新临床应用进展，给未来牙髓干细胞实现更广阔的临床转化应用提供理论及临床实践参考。

［关键词］  牙髓干细胞；生物学特性；临床前应用

      临床上，由各种原因导致的牙颌面硬组织缺损发病率高，大量神经性、血管性等软组织疾病也在寻求效果更为突出的治疗方法。牙髓干细胞(dental pulp stem cells，DPSCs)是一类存在于恒牙/乳牙牙髓内具有自我更新、多向分化、高度增殖能力的外胚间充质干细胞，它易于获得，免疫原性低，易保存，无伦理争议，不易形成肿瘤，较人体其他间充质干细胞更具优势。在适宜条件下，DPSCs可分化为多种人体细胞，为组织器官修复和多种疾病治疗提供细胞来源，被认为是很有前景的间充质干细胞。本文通过对DPSCs相关文献的总结，对DPSCs的分离与培养、储存与鉴定、增殖分化与迁移、代谢等一般生物学特性进行论述，并探讨其成骨/成牙本质、成肌/成血管、神经再生的机制及其在糖尿病和眼部疾患的临床前应用。同时，本文结合了国内外有关DPSCs的最新临床应用进展，给未来DPSCs实现更广阔的临床转化应用提供理论及临床实践参考。

01

牙髓干细胞的生物学性能

1.1

分离培养、储存与鉴定

      分离DPSCs最常用的是联合酶消化法，一般从阻生智齿、正畸减数牙的牙髓组织中获取。龋坏的牙齿一般不作为“提牙”的细胞来源，但是用1%聚维酮碘处理后，再提取的DPSCs增殖速度更快，符合国际细胞治疗学会对间充质干细胞的三个要求，扩大了再生医学的细胞来源［1］。牙库是收集直接用于临床一线的DPSCs的部门。许多国家的牙库已经建立起完善的DPSCs存取流程，包括收集、运输、干细胞分离、低温储藏等［2］。DPSCs本质上是一个细胞群体，它们在增殖能力、分化潜力、基因表达和表面标记物表达方面存在着差异。用流式分析仪对DPSCs进行鉴定，发现其阳性表达CD73、CD90、CD105 等间充质干细胞特异性表面标志物，不表达CD34、CD45等造血干细胞标记物［3］。

1.2

 多向分化

      干细胞的一个突出能力是多向分化，这也是DPSCs在组织再生中作为种子细胞的独特优势。通过适当的诱导，DPSCs能获得更为优越的分化效率。无血清冻存液悬浮状态下，将DPSCs置于-80 ℃冰箱冻存1年，复苏后仍具有多向分化的能力。将适宜浓度氯化锂溶液加入基础培养基中，DPSCs成骨分化明显，Wnt/β-catenin蛋白高表达。在诱导液中添加抗生素类制剂雷帕霉素，它能抑制mTOR通路，下调ERK及JNK基因表达水平，最终促进DPSCs成骨向分化［4］。研究发现DPSCs的染色体端粒长度以及CD271表达水平与其分化能力有着密切联系［5］。Michot等［6］发现降钙素基因相关肽会降低DPSCs的代谢活性和增殖，但对其成骨分化的过程不造成影响。

1.3

增殖和迁移

      Gronthos等［7］发现DPSCs的克隆增生率显著高于骨髓间充质干细胞，并在传代中依然保持着较高的增殖能力。DPSCs增殖和迁移能力涉及众多信号通路，有学者利用DPSCs条件培养基培养DPSCs,发现其迁移能力的提高是脑源性神经营养因子与受体TrkB结合以及神经营养因子4/5与细胞迁移相关因子ERK结合的结果；Hippo信号通路下游转录因子TAZ亦通过介导TGF-β信号通路调节结缔组织生长因子和富半胱氨酸生长诱导物Cyr61，促进DPSCs的增殖和迁移；胶质源性神经营养因子促进DPSCs的迁移，涉及PI3K/AKT 及 MEK/ERK信号通道，未来将研究其是否可作为盖髓材料的辅因子；血管内皮生长因子作用于受体，激活FAK/PI3K/AKt和p38/MAPK通路，促进DPSCs的迁移［8-11］。有学者将抗生素MET、CIP分别加在纤维支架上与溶液中，并进行细胞增殖对比，发现纤维支架状态更有利于DPSCs增殖［12］。在辛伐他汀的临床应用背景下，有学者将其用于DPSCs的研究，发现它能显著促进DPSCs的增殖，有望用于临床上牙髓切断术后的牙髓再生［13］。

1.4

代谢

      与其他间充质干细胞一样，虽然DPSCs自身代谢较稳定，但也会受到多种因素的调控，可塑性亦很强。Duailibi等［14］对DPSCs进行细胞遗传学分析，发现细胞生存环境的改变能导致细胞内染色体数量及结构的畸变，且大部分是有益于细胞的适应性变异。对DPSCs进行糖代谢分析，发现在DPSCs分化的早期，糖代谢不受氧压和个体差异的影响，但会从早期未分化状态的糖酵解变成分化状态的糖酵解和三羧酸循环同时存在［15］。Al-Habib等［16］发现小分子物质如Pluripotin、雷帕霉素能降低DPSCs干性，而6-溴靛玉红-3-肟则可以维持DPSCs的干性。抑制DPSCs凋亡的目标可通过肾上腺髓质素作用于PI3K/Akt信号通路和miRNA-224直接抑制Rac家族小GTP酶两种方式，进而间接抑制丝裂原活化蛋白激酶JNK和凋亡信号通路FasL来实现，而miRNA-152则靶向降低SIRT7，促进DPSCs的凋亡［17-19］。

02

牙髓干细胞的临床前探索

2.1

 成骨/成牙本质

2.1.1  组织工程骨的探索

      构建组织工程骨最为重要的就是构造骨的外形和释放细胞因子的介质。Tatsuhiro等［20］在单层培养基上获得DPSCs薄片，而后放在成骨培养基中3D立体培养获得能分泌细胞外基质和钙化基质的立体构造物，将其作为支架用于培养DPSCs能促进其成骨分化；Sevari等［21］用海藻酸盐联合基质胶，再复合生物活性玻璃水凝胶作为支架封装DPSCs后，其成骨分化能力得到提升；Toh等通过调整PEG-Fibrinogen水凝胶的交联度和硬度，得到人工细胞外基质，联合DPSCs培养后促进其成骨/成牙本质分化；亦有学者设计了微重力下动态旋转培养系统，通过联合PLAG支架和经典成骨诱导培养基，促进DPSCs的成骨分化；Nakashima等获取作为支架的细胞基质，联合BMP-4后成功地诱导了DPSCs成牙本质向分化；Yanasse等［25］利用富血小板血浆作为支架，联合DPSCs后植入兔软骨缺损处，兔透明软骨全层逐渐得到修复，而滑膜内层增厚现象减少，防止了滑膜炎的发生；Elwerfelli等［26］通过SDS、TritonX-100对牙髓进行循环脱细胞处理，保留了其组织特异性生长基质，联合DPSCs培养后，牙髓牙本质复合体大量形成，给牙髓再生的研究提供了良好的方向［20-26］。即便如此，目前尚无具有理想代谢率的支架材料，细胞因子的释放周期难以调控。

2.1.2  基因层次调控成骨分化的方向

      染色体上特殊序列决定的牙本质涎磷蛋白能决定DPSCs分化方向，缺乏牙本质涎磷蛋白后DPSCs会向软骨细胞方向分化［27］。Choung等［28］通过基因芯片定位颅面组织胚胎发育过程中高度表达的LIM HOMEOBOX8基因，发现泛素特异性蛋白酶USP1能促进其底物ID1蛋白去泛素化，而USP1抑制剂ML323能抑制这个过程，促进DPSCs的成骨分化。转录因子SP1通过调控ERK2促进底物BMP-2的产生，同时抑制BMP靶点抑制剂的分泌型蛋白NOGGI的作用，促进DPSCs的成骨分化［29］。如何在基因层面进行精准调控则是未来需要聚焦的重大课题。

2.1.3  宏观理化因素对成骨分化的影响

      理化因素作为诱导因子也扮演着重要角色：低分子量鱼精蛋白-超氧化物歧化酶能穿透DPSCs的细胞膜，抑制过氧化氢对细胞的氧化应激损害，促进其成骨向分化［30］ ；低强度激光预处理DPSCs促进其成骨分化，机制尚不明确［31］；Oliveira等［32］用适宜直流电刺激DPSCs，促进了DPSCs的成骨/成牙本质分化，极大地提高了组织工程骨的构建效果；适宜浓度的锶亦可促进DPSCs的成骨/成牙本质分化［33］。但是应该更多的从宏观变化来探讨其具体成骨机制，为未来的宏观精准调控奠定基础。

2.2

成肌/成血管

      自Gronthos等发现DPSCs以来，成肌分化亦成为研究热点。有学者利用5-Aza-2-脱氧胞苷抑制DPSCs中miRNA-135以及miRNA-143表达，成功促进了DPSCs向肌细胞的分化［34］。亦有学者利用miRNA-126转染人乳牙DPSCs(早期外胚叶间充质组织头部的神经嵴细胞迁移生出的牙髓间充质干细胞)，发现其血管样结构、CD31、血管内皮生长因子R2、血管生成素-1均显著增加［35］。用含血管内皮生长因子的培养基诱导人乳牙DPSCs成血管分化，出现血管样结构，血管内皮细胞表面标记物免疫荧光呈阳性［36］。Sugiyama等［37］栓塞小鼠大脑中动脉制备短暂性局灶性脑缺血再灌注模型，CD31阴性和CD146阴性的牙髓干细胞侧群（side population，SP）细胞植入的低血区有大量的小鼠内皮细胞抗原表达，他们认为，SP细胞可促进内皮前体细胞的迁移和分化，诱导低血区血管发生。

2.3

神经再生

      Ahmed等认为DPSCs分泌的一些细胞因子对逆转阿尔茨海默病起着关键性作用，它们能刺激内源性存活因子Bcl-2，降低凋亡调节因子Bax［38］。有人用3-乙酰吡啶诱导大鼠小脑共济失调模型，DPSCs移植入相应区域后分化为神经胶质细胞和神经元，体视学见小脑分子层、颗粒层和白质体积明显增加，炎症细胞因子水平下降，浦肯野细胞的退化也被遏制［39］。有学者利用内皮细胞和星形胶质细胞共培养建立血脑屏障模型研究脑卒中治疗方法，他们向血管注射DPSCs后，增强了血脑屏障的通透性，促进了干细胞的粘附和迁移，对中风治疗产生积极影响［40］。Sowa等利用腺病毒载体转染形成过表达肝细胞生长因子的DPSCs，促进脑缺血-再灌注后的血管生成，延长了急性脑卒中治疗的窗口期［41］。常规治疗脊髓损伤的方法会形成胶质瘢痕，Feitosa等［42］构建了狗的慢性脊髓损伤模型，他们用未成熟的DPSCs移植到脊髓损伤区域后，狗的肢体功能得到明显的改善。Gnanasegaran等［43］探究在体外炎症微环境中DPSCs对神经元和小胶质细胞的影响，为帕金森病治疗寻找替代方法，未来可能成为个性化细胞替代疗法的关键一步。

2.4

糖尿病

      Datta等［44］用链脲佐菌素建立大鼠糖尿病神经病变模型，他们将DPSCs经肌肉重复注射后，大鼠痛觉过敏症状、握力、运动协调性和神经传导速度均有所改善，未来还需要对其脂肪代谢、胰岛再生等方面进一步研究。Makino等［45］认为移植细胞很少能在移植部位存活，他们在大鼠后肢骨骼肌注射浓缩10倍的DPSCs条件培养基后，增加了巨噬细胞中抗炎标志性因子CD206和IL-10的表达，诱导了M2极化，延长了背跟神经节细胞的突起生长，增加了施万细胞的增殖和髓鞘形成，糖尿病多发性神经病变得到恢复，作为治疗糖尿病多发性神经病变的一种无细胞治疗策略，未来还需要进一步研究其注射的剂量、治疗时间和疗效持续时间。Kanada等［46］探究DPSCs及DPSCs分泌因子对糖尿病多发性神经病变的影响，发现发挥作用的还是细胞的分泌物。

2.5

临床实践

      角膜移植手术给因角膜致盲的患者带来曙光，但存在角膜供体短缺、移植物长期保存困难以及移植物排斥反应和伦理冲突等问题。DPSCs因其与角膜组织共同来源于胚胎外胚层的神经嵴，具有分化为角膜各层组织细胞的潜力，成为研究的热点。体外培养的DPSCs能够表达与角膜缘干细胞相同的分子标记物。未分化的DPSCs亦能够表达角膜上皮细胞特异性标志物细胞角蛋白。羊膜组织和软性角膜接触镜作为角膜重建中的生物载体以及DPSCs能够明显改善受损角膜的透明度进而防止角膜上皮结膜化的研究已深入；以人类未成熟DPSCs结合作为生物支架的去上皮羊膜，通过特殊的诱导方式进行培养能重建眼表；DPSCs亦能通过恢复视网膜色素上皮细胞和光感受器细胞治疗视网膜退行性疾病［47-49］。长期的效果还需要更丰富的临床实用经验来进一步验证。

03

牙髓干细胞的临床应用进展

3.1

牙髓再生

      再生移植体植入根管前需要一个相对无菌且洁净的环境，有学者利用1 mg/mL抗生素DAP对根管进行消毒处理后，再用EDTA进行清洗，基本消除了残留的DAP对根管产生的影响，DPSCs的增殖和附着得到明显提高，这可能归因于EDTA有能力洗去牙本质中残留的DAP，并暴露各种牙本质基质成分和生长因子［50］。牙髓再生研究的焦点集中于可注射支架，利用支架搭载种子细胞和微环境则可以实现这个过程。典型的可注射聚L-乳酸微球支架和自组装纳米纤维海绵微球支架等，它们的特性包括：高表面积和纳米纤维结构有利于细胞与材料的相互作用；在体内降解的过程是可控的、渐进的、缓慢的，能模拟细胞外基质相互连通的纤维多孔结构；能够搭载DPSCs进入不规则的根管，使移植体尽可能充满整个根管。通过低氧3D培养复合物，转录因子HIF-1表达上调，后者促进血管内皮生长因子生成，移植后组织血管密度与天然牙髓组织结构一样，且牙本质-牙髓界面出现特征性的成牙本质细胞内衬。在高仿生体内模型中注射聚L-乳酸微球支架-DPSCs复合物后，根管内大量表达Ⅰ型胶原和牙本质形成蛋白，促进了牙本质再生，此技术有望替代惰性根管充填材料，促进有效的牙髓-牙本质复合体再生，使根管治疗长期的效果更佳［51,52］。

3.2

骨再生

      组织工程骨是通过种子细胞、生物支架、细胞因子三者联合植入骨缺损处，用于取缔自体或同种异体骨移植的一种骨再生的方法。近年来，国内外有许多将组织工程骨成功用于临床骨缺损的报道，目前处于比较前沿的是：机械解聚牙髓获得富含干细胞的自体微型移植物，后者与胶原支架结合后用于骨再生。机械解聚能在很小的自体牙髓样本中产生数百万个微型移植物，50 μm滤网过滤后，通过衰老分化细胞的排出和年轻干细胞的富集，获得的细胞与酶消化后的细胞完全相似，整体移植用于牙周围骨组织再生，避免了收集牙髓和分离间充质干细胞的过程，术后临床和影像学效果显著［53］。有学者收集了扩增培养的DPSCs，联合胶原基质支架植于下颌智齿拔牙窝，再生的骨血管分布均匀，骨密度和牙槽间隔显著提高，有效减少了拔牙后牙槽骨的吸收［54］。

3.3

神经再生

      常规药物大都通过血液循环进入大脑，这在急性期似乎是可行的，但慢性期完整血脑屏障的存在则使其疗效难以达到满意的效果。学者们另辟蹊径，选择颅内注射DPSCs。由于慢性期可能出现神经替代、血管生成和神经可塑性现象，他们利用老年人自体适宜浓度的DPSCs，采用特殊的方式注射至中度至重度残疾的中风幸存者脑部梗死灶及其周围，通过术前及术后多次观察分析得出结论：自体DPSCs治疗中风后慢性症状是安全的、可行的［55］。也有DPSCs分化为神经前体细胞，再将其与提供微环境和神经营养因子的片状蜗螺旋神经节共培养后移植改善感音性耳聋的报道等。

3.4

其他

      自2020年初新型冠状病毒疫情爆发以来，领域内学者在已有的DPSCs研究成果的基础上，开展了异体DPSCs用于治疗重症COVID-19的临床试验，在小样本量下，对实验组和对照组分别进行安全性和有效性的对比评估，各项临床指标试验结果有统计学意义，展示了其在应对突发性临床及公共卫生事件中的巨大优势［56］。国内在王松灵院士团队的引领下，有关DPSCs的研发专利层出不穷，涉及医疗多个前沿领域：DPSCs用于治疗或预防神经性疾病、风湿性疾病、肥胖症和/或代谢综合征的研究正在不断深入；体外诱导DPSCs向膀胱平滑肌细胞、心肌样细胞分化的方法也获得了一大批专利成果；牙齿相关干细胞、基因修饰的牙源性干细胞的用途也在临床上不断拓展；在支架开发方面，有促进骨缺损修复的埃洛石复合水凝胶的合成以及基于蛋清和甲基丙烯酸衍生化聚合物的复合膜制备，更是拓展了它们在培养干细胞方面的应用；TNF-α等增强DPSCs与脐静脉内皮细胞共培养的血管生成能力也予以转化应用；基于DPSCs对皮肤成纤维细胞衰老及增殖能力的影响，一种高保湿促润肤的重建儿童乳牙DPSCs面膜有望进入市场用于人体；亦有学者开发了DPSCs延缓女性卵巢早衰的技术等等。

04

展望

       DPSCs具有良好的自我更新与多向分化潜能，取材安全方便、易于扩增和保存，十分有利于临床研究与应用，基础研究颇为丰富，但其各项突出成果成功转化到临床实践的目标还未完全实现，累积的资料十分有限。移植到人体内后的相关机制、人类对异体DPSCs的排斥反应以及应用后的长期临床效果等，国内外都还没有深入研究报道。因此全面研究DPSCs的性质，进一步加强基础-临床转化研究将是未来几年亟待解决的课题。伴随着材料学、分子生物技术、组织工程再生技术的进一步发展，必定会真正实现DPSCs的临床转化应用。

来源：口腔医学，2022,42（1）：1-7.